折射率（Refractive index, RI）是材料的一个基本物理性质，不仅能用于区分不同化学组成的纳米颗粒（Nanoparticles, NPs），而且是动态光散射、流式细胞术、表面等离子体共振显微镜和光干涉测量法等检测技术基于光散射实现NPs粒径精准测量必须提前知晓的重要物理参数。其中，病毒、细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）等生物纳米颗粒由于其粒径极其微小、异质性大、散射信号弱等因素，大大阻碍了对这些生物纳米粒子RI的测定。

厦门大学化学化工学院的颜晓梅教授研究团队结合瑞利散射和鞘流单分子检测技术成功研发纳米流式检测技术（Nano-flow cytometry, nFCM），将纳米金，SiO₂纳米颗粒（SiNPs）、病毒、EVs的单颗粒检测下限分别推进到7，24，27，40 nm。今日，该研究团队创新性地将nFCM的侧向散射光检测与米氏（Mie）散射理论计算相结合，借助SINPs粒径标准球，建立了无标记的单个病毒和小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）的RI测定方法；并进一步根据所测得的RI，对病毒内腔核酸浓度和sEVs内腔蛋白浓度进行了估算。此外，通过核-壳模型，研究团队得到40-200 nm粒径范围内sEVs的RI分布，并利用该RI和nFCM测定了sEVs的粒径分布表征，其结果媲美冷冻透射电镜。该研究成果以“Refractive Index Determination of Individual Viruses and Small Extracellular Vesicles in Aqueous Media Using Nano-Flow Cytometry”为题，在Analytical Chemistry期刊上以Front Cover的形式发表（Anal. Chem. 2022, 94(41）: 14081-14502) 。

米氏散射理论可以准确求解任意尺寸及材料的球形颗粒的散射强度，对于粒径已知的颗粒，获得其Mie散射强度（Mie intensity）即可求得其RI。首先，作者使用粒径和RI已知的SiNPs为标准球建立了SSC和Mie intensity的关系曲线，将待测纳米颗粒的SSC转换为对应的Mie intensity；进一步利用该Mie intensity与RI的关系曲线计算得到待测纳米粒子的RI。

作者首先以160、200、240和500 nm聚苯乙烯微球为研究模型，计算得到其RI为1.586 ± 0.010，与文献报道的RI（1.5983和1.5956）极其吻合，验证了该方法的准确性。作者通过对T7噬菌体及其空壳的散射光信号的检测，分别计算其RI为1.455和1.390。根据Lorentz-Lorenz公式计算其内腔RI分别为1.448和1.363。T7空壳内部折射率与其储存溶液（1.30 g/mL CsCl溶液）极其接近。随后使用纯水对T7空壳样本进行透析，测得其内腔折射率为1.335，与纯水折射率1.332相吻合。进一步验证了该方法的准确性和物质组成分辨能力。作者进一步实现了T7噬菌体及其空壳内腔中核酸浓度的定量分析，分别为0.663和~ 0 g/mL。

相比于噬菌体，sEVs的粒径分布具有极大的异质性。为了实现sEVs RI的测定，作者首先采用冷冻透射电镜对人结直肠癌细胞系HCT15来源的EVs的粒径分布进行了表征，并分别在70和160 nm处观察到两个峰值。随后，基于所建立的RI测定方法，得到这两个亚群的sEVs的RI值分别为1.380和1.369，并计算得到其内腔RI分别为1.340和1.351，所对应蛋白浓度分别为0.044和0.104 g/mL。

作者进一步通过将sEVs简化为核-壳模型，得到了40~200 nm之间不同粒径大小sEVs所对应的折射率。利用该RI对由于RI不同所导致的同样粒径的sEVs和SiNPs粒径标准球的散射强度的差异进行校正，建立了单个sEVs的散射光强度和粒径的标准工作曲线，并通过nFCM对单个sEVs散射光的检测，得到媲美冷冻透射电镜的粒径分布表征结果。

该论文由厦门大学化学化工学院田野博士和薛乘风共同第一作者完成。该工作得到国家自然科学基金委项目（21934004和21627811）、中国博士后科学基金（2019TQ017）和中国重点研发计划专项（2021YFA0909400）的资助。

论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c02833